由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是世界范围内危害最为严重的真菌性病害，产妇护理13825404095能够侵染包括番茄(Solanum lycopersicum)、黄瓜(Cucumis sativus Linn)、草莓(Fragaria ananassa Duch)等蔬菜水果在内的200多种植物。灰葡萄孢菌(B. cinerea)为死体营养型病原真菌，可以产生多种植物毒素和细胞壁水解酶来杀死植物寄主细胞，由于灰葡萄孢菌(B. cinerea)具有多种侵染模式且菌核在植物残体上长期存活并产生抗药性，导致灰霉病难于防治。据统计，每年世界上用于灰霉病防治的费用超过十亿元，即使如此该病仍给农业带来了数十亿的经济损失。与此同时，用于灰霉病防治的化学农药大量进入环境和食物，带来了严重的环境污染和人体伤害。因此，进行灰霉病的安全高效防治是目前亟待解决的问题。
木霉(Trichoderma spp.)属于半知菌亚门，丝孢目，从梗孢科，木霉属，是最具生防潜力的灰霉病防治真菌，在世界范围内普遍应用。对木霉防治灰霉病的作用机制研究是木霉生防研究的重点领域，本文主要对木霉防治灰霉病的直接和间接生防机制以及间接防病过程中所涉及的互作模式、传导途径以及引起植物防御反应进行综述，以期通过机制的深入研究找到进一步提高木霉生防效果的技术方案。
1 木霉防治灰霉的直接作用机制 1.1 木霉的重寄生作用木霉能够通过重寄生对病原菌进行识别、接触、缠绕和穿透等一系列作用来抑制或溶解寄主菌丝，是木霉最重要且存在最为广泛的生防机制之一。Druzhinina等[]对木霉属中75个种的1 100个菌株进行验证发现，所有的菌株都具有对灰霉的重寄生能力。Card等显微观察了深绿木霉(T. atroviride) W132对灰霉病菌的拮抗作用，观察到木霉菌丝沿着灰霉平行或缠绕生长以及随后的灰霉菌丝崩解死亡的过程[]。不同菌株产生细胞壁降解酶类的能力不同，重寄生能力较强的绿色木霉(T. virens)和深绿木霉(T. atroviride)产生的细胞壁降解酶类较多，而重寄生能力弱的里氏木霉(T. reesei)产生的细胞壁降解酶类较少[]。木霉产生包括β-1, 3-葡聚糖酶、β-1, 6-葡聚糖酶、蛋白酶等在内的各种细胞壁降解酶类，无病原菌存在时这些酶类低量组成型表达，当有灰霉存在的情况下，β-1, 3-葡聚糖酶[]、β-1, 6-葡聚糖酶以及蛋白酶的活性均上升[]。Yang等的研究结果也发现，灰霉菌能够诱导哈茨木霉(T. harzianum) EST323产生多种细胞壁降解酶类，引起灰霉菌细胞壁的降解和菌丝崩解[]。同样，在灰霉菌存在的情况下，棘孢木霉(T. asperellum) T32中α-1, 3-葡聚糖酶大量表达[]。Mukherjee等分析绿色木霉(T. virens)、深绿木霉(T. atroviride)以及里氏木霉(T. reesei)与灰葡萄孢菌(B. cinerea)的重寄生过程发现，木霉与病原菌相互识别、接触的初级阶段灰霉细胞壁被木霉的细胞壁降解酶降解且释放低聚物，这些低聚物会诱导木霉细胞壁降解酶类的大量产生，进一步加快了对灰霉细胞壁的降解，导致菌丝崩裂[]。通过分析木霉与灰霉互作过程中的转录组测序发现，灰霉对木霉细胞壁降解酶基因的诱导表达开始于二者直接接触之前[]。总之，木霉能产生较为全面的细胞壁降解酶系，这些物质在灰霉菌存在时大量诱导表达。木霉产生的这些酶类除了能够导致寄主菌丝细胞壁降解外还能够诱导木霉寄生于灰霉的菌丝之中、阻止灰霉生长，对灰霉起到防治的作用。
1.2 木霉的抗生作用抗生作用是木霉防治灰霉的另一种重要的直接生防机制，该作用是通过产生多种具有抗生活性的次级代谢产物来实现的，目前已经发现木霉所产生的抗生物质分为两大类，一类是小分子、易挥发性物质，包括芳香族化合物、聚酮化合物、丁烯酸内酯类及萜烯类等，该类物质对包括灰霉在内的大多数病原真菌具有抑制活性[]。另一类物质是大分子代谢产物，包括Peptailbols、酶类等。Peptaibols是木霉最主要的活性抗生物质，目前发现的317种Peptaibols大多由木霉产生[]，是一种短链的非核糖体多肽，具有3个结构特点：(1) 含有高比例的非蛋白质氨基酸残基或脂氨酸，尤其富含α-氨基异丁酸(Aib)；(2) 具有烷基化的N末端和羟基化的C末端；(3) 具有线性α-螺旋，分子量大多为500−2 000 Da，分子长度在5−20残基之间，多为15−20个残基[]。Chugh等研究发现，Peptaibols的两亲性质使其能够结合到双跨膜的灰霉细胞壁的低聚体离子通道上，使细胞渗漏和死亡[]。Schirmböck等研究发现，灰霉细胞壁可以诱导哈茨木霉(T. harzianum)中Trichorzianine A1和A2的产生，这两种Peptailbols可以抑制灰霉孢子萌发和菌丝延长[]。木霉与灰霉作用过程中还产生一些没有细胞壁降解酶活性，但在生防过程中起重要作用的酶类。如Yang等从哈茨木霉(T. harzianum) ETS323的分泌蛋白中分离到了一种L-氨基酸氧化酶(LAAOs)同聚体[]，LAAOs是一种黄素酶，可以特异性催化L-氨基酸的主体氧化脱氨生成α-酮酸，同时释放过氧化氢和氨，引起灰霉菌丝的细胞凋亡[-]。木霉生长过程中会产生众多不同类型的具有抗生活性的次级代谢产物，这些代谢产物通过抗生作用抑制灰霉孢子萌发、阻止菌丝生长、进行菌丝的裂解，达到防治灰霉病的作用。
1.3 木霉的竞争作用木霉是一种环境适应性强、生长速度快的真菌，在与其他微生物在同一生态位存在时能够迅速占领营养和空间，使得竞争作用成为木霉的一种重要的拮抗机制。木霉的竞争作用主要表现为对生存空间和营养的竞争。王勇等通过平皿对峙法筛选到了2株高效拮抗灰霉菌的木霉菌株，这两个菌株的生长速度为灰霉菌生长速度的1.5倍左右，能够通过营养和空间竞争抑制灰霉的生长[]。在自然环境中，灰霉菌丝侵入植物组织的位点为营养丰富的植物伤口、衰老的组织以及气孔、皮孔等自然孔口，侵入植物细胞之前需要依赖植物表面的营养才能萌发和生长，木霉在这些位点迅速萌发和生长会与灰霉进行营养竞争，导致灰霉孢子萌发率降低、芽管伸长变慢，从而降低和阻止灰霉的侵染，减少病原菌发病点的数目和植物坏死面积[-]。Card等通过显微观察的方法发现深绿木霉(T. atroviride)通过营养竞争抑制灰霉在草莓叶片上生长，木霉处理过的草莓叶片上的灰霉孢子萌发的芽管长度比未处理组短25%[]。
前期研究表明，木霉能够通过直接抑制灰霉生长达到良好的生防效果，木霉的直接生防机制包括重寄生、抗生和竞争作用，这些作用在有些菌株中同时存在、不分伯仲，在另一些菌株中则以一种为主，明确木霉的直接生防机制为我们有的放矢地防治灰霉病提供了理论指导。
2 木霉防治灰霉的间接作用机制关于木霉生防机制的早期研究主要集中在木霉与病原菌之间的直接作用，而忽视了寄主植物的参与。近年来人们发现，有些木霉菌株能与植物建立共生关系，并激活植物的防御系统、降低植物的发病率[]，该机制称为木霉诱导的植物系统抗性，是木霉防治灰霉的间接作用机制，也是目前木霉生防机制研究的热点。
2.1 木霉与植物互作木霉防治灰霉的间接作用机制包括三步：木霉与植物互作、植物信号传导途径的激活以及植物诱导系统抗性(ISR)反应。木霉与植物互作过程中，首先是木霉在植物中定殖，在这一过程中，木霉菌丝缠绕在植物根上，形成类似附着胞的结构，最后穿透根系皮层，在植物表皮和皮层的细胞间生长[-]。不同木霉菌株的定殖能力不同，一些木霉菌株仅能定殖于植物根系的局部，而另一些菌株则能够在整个根系定殖[]。木霉在植物表面的定殖能力与赖氨酸基序(LysM)蛋白基因相关，含有编码LysM蛋白基因的木霉菌株具有较强的植物定殖能力[]。
植物信号传导途径的激活是木霉产生的活性物质被植物识别引起诱导系统抗性的过程，被植物识别的微生物决定因子叫作微生物相关分子模式(MAMPs)。有益微生物中存在多种MAMPs来诱导植物ISR的产生，该机理与植物-病原菌互作的机制相似[]。木霉释放多种MAMPs分子来激发免疫反应(MAMPs-triggered immunity，MTI)诱导植物系统抗性，目前已经明确的木霉效应因子有10多种，包括丝氨酸蛋白酶、22 kD木聚糖酶、几丁质酶、几丁质脱乙酰基酶、SnodPort1蛋白、脂肽等。Djonović等在研究绿色木霉(T. virens)与玉米互作过程中发现了一个表达和分泌量增加的蛋白sm1，该蛋白可以作为激发子诱导玉米局部和系统抗性相关基因的表达，进一步启动了植物的系统抗性。与野生型绿木霉(T. virens)相比，缺失或过量表达Sm1的木霉突变株在玉米根部定殖会降低或增强玉米对病原菌的抗性[]。Rotblat等研究发现绿色木霉(T. virens)中含有一种乙烯诱导的木聚糖酶，该活性物质可以强力诱导番茄(S. lycopersicum)和烟草(Nicotiana tabacum L.)的系统抗性[]。Peptailbols和一些次级代谢物除了能够直接抑制病原菌外，也能诱导植物产生抗病性[-]。另外，木霉产生的酶类降解植物细胞壁所产生的多糖类、低分子量化合物也是能诱导植物产生系统抗性的激发子[-]。
自Bigirimana等[]首次发现木霉可诱导植物系统抗性之后，研究者们采用病理学、分子生物学等多种手段证明了绿色木霉(T. virens)、棘孢木霉(T. asperellum)、深绿木霉(T. atroviride)、哈茨木霉(T. harzianum)等均能诱导植物获得系统抗性，对木霉与植物互作过程中所涉及的信号识别、定殖过程进行了大量研究，使利用木霉的诱导抗性进行灰霉的防治更为可行。
2.2 木霉诱导植物系统抗性的信号传递途径在植物对木霉MAMPs识别的过程中，促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应作为植物早期反应被激活，MAPK级联反应将胞外信号刺激转变为胞间反应扩大的同时将信号经过三级可逆磷酸激酶进行传递[-]，MAPK系统的激活导致底物蛋白的磷酸化以及与之相连接的一系列相关信号分子的改变。Shoresh等的研究表明当植物根部接种棘孢木霉(T. asperellum) T203后，黄瓜(C. sativus Linn)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的MAPK和MPK3途径分别被激活[]。Mathys等通过高通量测序技术分析了拟南芥(A. thaliana)根部接种钩状木霉(T. hamatum) T382后的转录组，研究发现木霉的根部接种导致拟南芥(A. thaliana)叶片中的MPK3同源物和MAPK激酶编码基因(MKK4) 受到诱导表达，激活拟南芥(A. thaliana)的系统抗性，灰霉病的发生受到抑制[]。Lizasa等[]和Petutschnig等[]研究发现，拟南芥(A. thaliana)中的LysM受体蛋白激酶CERK1可以与几丁质结合，从而启动蛋白激酶的磷酸化级联反应，激发植物的系统抗性。Wan等研究也表明，拟南芥(A. thaliana)中LysM受体激酶在传导几丁质信号中起着重要的作用，几丁质能使拟南芥(A. thaliana)的抗病能力增强[]。Brotman等研究拟南芥(A. thaliana)接种木霉属(T. asperelloides) T203第24 h后发现拟南芥(A. thaliana)根部也存在着相同的GO过程[]。
随着分子生物学技术的发展，对木霉诱导的植物激素信号传递途径也有了较为明确的认识。植物激素的功能是将外界信号转换为有活性的防御反应，包括系统获得抗性SAR和诱导系统抗性ISR。其中SAR主要指由于病原菌感染所引起的植物抗性，在该过程中有水杨酸(SA)的参与、激活病程相关蛋白的表达，引起植物对病原菌侵染的长效抗性。ISR是由植物根围微生物所引起的植物系统抗性，所涉及的信号途径为茉莉酸/乙烯(JA/ET)途径。研究发现，在不同菌株、时间等环境条件下，木霉能够诱导植物产生SA介导SAR和JA/ET介导的ISR反应。
分析钩状木霉(T. hamatum) T382接种到拟南芥(A. thaliana)根部48 h之后拟南芥(A. thaliana)叶片的转录组发现，该阶段是以JA/ET信号通路为主的诱导系统抗性；另外，GO分析显示拟南芥(A. thaliana)中也出现了SA信号反应，SA途径的WRKY6、WRKY53、PR1、PR2、PR5等基因诱导表达，但该途径不占主导地位[]。本课题组采用Real time PCR的方法分析了长枝木霉(T. longibrachiatum) H9根部诱导黄瓜(C. sativus Linn) 72 h后SA和JA信号途径相关基因的表达情况发现，SA信号通路的基因PAD4和JA信号通路的基因LOX1、LOX2、AOS均出现上调表达，其中SA信号通路的相关基因上调表达更为明显，而接种木霉96 h后发现JA信号通路相关基因上调明显；对长枝木霉(T. longibrachiatum) H9诱导处理96 h后黄瓜(C. sativus Linn)叶片的转录组进行分析，KEGG结果显示与茉莉酸和乙烯相关的基因明显上调，表明木霉诱导植物产生的信号转导途径存在时效性(未发表)。Ruocco等[]使用长枝木霉(T. longibrachiatum)进行番茄(S. lycopersicum)的处理得到了相似的结果，在番茄(S. lycopersicum)感应木霉的初期阶段水杨酸大量积累，含量多于JA，在这一阶段SA起主导作用，后期JA含量有所增加，说明在木霉与番茄(S. lycopersicum)互作过程中会先后激活番茄(S. lycopersicum)的SA和JA途径。Morán-Diez等[]分析接种哈茨木霉(T. harzianum) T34后24 h时的拟南芥(A. thaliana)叶片转录组结果发现只有极少数基因存在差异表达，而SA和JA/ET信号通路的标记基因为下调表达，接种48 h后再次进行转录组分析发现两个通路的标记基因则都出现显著上调，该结果显示哈茨木霉(T. harzianum) T34限制初始的植物防御反应，从而使其在植物根部顺利定殖。与Morán-Diez的结果不同，Brotman等[]在拟南芥(A. thaliana)根部接种T. asperelloiles 24 h后对拟南芥(A. thaliana)的转录组分析发现，JA生物合成的相关基因WKRY18和WKRY40表达量显著上调，这两个转录因子通过抑制JAZ因子的表达来激活JA信号通路，拟南芥(A. thaliana)的防御相关基因表达未出现下调。
Korolev等[]研究了植物经木霉诱导后对灰霉抗性的表型，得到了更多关于SA、JA/ET介导的木霉诱导植物系统抗性的证据，用哈茨木霉(T. harzianum) T39处理拟南芥(A. thaliana)根部，所有JA/ET途径的突变体都不能响应木霉诱导产生对灰霉的抗性，而野生型拟南芥(A. thaliana)能够产生对灰霉的诱导抗性。同样，哈茨木霉(T. harzianum) T78定殖于番茄(S. lycopersicum)根部之后，野生型番茄(S. lycopersicum)能够降低灰霉的侵染，但是JA、SA或ABA途径受阻的突变体则不能产生灰霉病抗性，说明JA、SA等激素在木霉诱导信号传递过程中具有一定作用[]。另外，利用不同的番茄(S. lycopersicum)突变体也确认了JA信号传递途径在传递木霉信号、激发对灰霉病系统抗性过程中所起的作用[]。
由近年来的研究结果可以看出，木霉能够激活SA和JA/ET信号传导途径，但是不同的环境条件如：木霉菌株、试验作物、测定时间等，其信号传导途径会存在很大的差别，因此规范试验条件、增加供试植物及木霉菌株的种类以进一步明确二者之间互作的反应模式对木霉的稳定应用具有重要的意义。
2.3 木霉诱导植物产生的次级代谢物木霉与植物互作会诱导植物体内产生一些次级代谢产物，如苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶、过氧化酶、几丁质等，这些次级代谢产物在灰霉防治中起着重要的作用。黄亚丽等的研究表明，将哈茨木霉(T. harzianum) Tr-92接种到黄瓜(C. sativus Linn)根部后，叶片中的过氧化物酶、多酚氧化酶、β-1, 3葡聚糖酶、苯丙氨酸解氨酶等酶活性显著上升，灰霉的发病率降低[]。无菌水培条件下，用棘胞木霉(T. asperellum) T-203菌株处理黄瓜(C. sativus Linn)幼苗时，黄瓜(C. sativus Linn)体内PAL和HPL的含量增加[]。PAL是苯丙素途径的第一辅酶，是产生抗菌酚类物质以及水杨酸的主要途径，Brotman等研究发现将T. asperelloides T203处理拟南芥(A. thaliana)根部后，苯丙素途径PAL1、PAL2和4CL基因均上调表达[]。将钩状木霉(T. hamatum) T382接种到苯丙素合成途径的拟南芥(A. thaliana)突变体时，木霉不能激发这些突变体对灰霉的诱导系统抗性(ISR)，进一步说明苯丙氨酸解氨酶类物质在植物抵抗灰霉方面的作用。Calderón等证明了绿色木霉(T. virens)的激发子处理葡萄细胞悬浮液后，其中的白藜芦醇含量增加，白藜芦醇是一种具有灰霉抑制活性的抗毒素[]。Shoresh采用转录组分析和花青素含量定量分析确定了钩状木霉(T. hamatum) T382接种于拟南芥(A. thaliana)根部后花青素的合成被显著诱导[]。
综上所述，木霉除了能够采用直接方式拮抗灰霉之外，还能通过定殖于植物根部并成为植物的共生体进而诱导植物产生抗病性的间接方式进行灰霉的防治。该过程是一个复杂的过程，涉及到木霉对植物信号的识别定殖、木霉信号在植物中传导、引起植物激素分泌和基因表达的变化，最终体现为植物抗病能力的增强。
3 展望木霉是应用最为广泛、生防能力最强的真菌生防因子之一，在化学农药的替代化和减量化方面起着重要的作用，木霉生防机制的研究一直是生防工作的热点。木霉对灰霉的防治存在多机制性，包括重寄生、抗生及竞争的直接拮抗作用以及诱导植物系统抗性的间接拮抗作用，木霉的田间防效常常是多种机制协同作用的结果。随着研究的深入，发现木霉的生防机制非常复杂，常因木霉的种类、菌株、寄主植物的不同而变化，木霉诱导植物产生系统抗性时也存在明显的时效性和剂量性，生防机制不明会引起木霉的不正确使用并造成木霉生防效果的波动。因此，明确木霉的生防机制并指导木霉制剂的合理应用是进一步稳定和提高木霉制剂防效的关键。然而，到目前为止，对木霉拮抗机制的研究特别是涉及木霉-植物-灰霉三方互作研究仅涉及少数木霉菌株和拟南芥(A. thaliana)、番茄(S. lycopersicum)和莴苣(Lactuca sativa)等少数植物，关于木霉诱导植物产生灰霉病抗性的基因组、转录组和蛋白组分析的报道也很少。随着蛋白组学和生物信息学的发展，特别是第三代测序技术的建立，对木霉-植物-灰霉三方互作的研究会越来越深入，并且三方互作系统中有用序列越来越多，这也会加深研究者对木霉-植物-灰霉三方互作机制的认识，为木霉的田间应用提供更多的理论依据。
