摘要：
全球变化新形势下,如何进一步提升农业生产力以确保粮食安全,对国民经济发展和国家安全具有重大战略意义.应对病虫害,干旱,盐碱,重金属污染,极端温度等环境胁迫对农业生产的挑战,除选育植物抗逆品种,应用化学药剂外,还可利用安全有效且环境友好的微生物,如PGPM(Plant growth-promoting microbes)来实现作物优质高产已成为可持续农业发展的重要手段.PGPM即植物促生菌,可通过直接或间接作用在微生态系统中对植物发挥促生,抗逆,防病作用以及对土壤发挥改良,修复作用.目前,已有多种PGPM作为生防菌得到广泛应用.解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一种革兰氏阳性PGPM,对其代表菌株FZB42的研究发现,该菌能够通过根际定殖和释放挥发性有机物(VOCs)促进多种植物如拟南芥,百合,枸杞等的生长和抗病抗逆.然而由于不能有效定殖而造成的PGPM制剂的促生防病效果不稳定,对其扩大应用造成制约.因此,筛选促进PGPM定殖的有效物质成分,将显著提高PGPM制剂的应用效果和稳定性.蔗糖等小分子碳源由于能被微生物直接代谢利用,兼具价格低廉等特点,具备成为PGPM增效剂的前提条件.然而,目前关于添加小分子碳源诱导PGPM的定殖,促生以及调节根际微生态的研究均鲜见报道. 本研究以拟南芥为植物材料,通过外源添加多种小分子碳源,确定蔗糖为解淀粉芽孢杆菌定殖的最适碳源,利用转录组学初步探究了蔗糖对解淀粉芽孢杆菌的定殖及促生作用.同时,以药用植物大黄和作物马铃薯为试验材料进行大田试验,基于多组学技术开展了解淀粉芽孢杆菌和蔗糖添加对植物根际微生态效应的研究.此外,通过对分离鉴定的PGPM菌株进行生防评价,确定了复合PGPM菌群的促生抗病能力显著优于单一接种.主要研究结果如下: 1.本研究通过外源添加多种小分子碳源,利用GFP标记的解淀粉芽孢杆菌FZB42筛选有效促进其定殖拟南芥的最适碳源种类及浓度,结果表明FZB42-GFP接种拟南芥后在1/2 MS平板,蛭石条件共培养时,1-2%的蔗糖显著促进其定殖能力(P<0.05);在无菌土壤中,1.5‰的蔗糖显著促进FZB42的定殖及拟南芥的鲜重和干重(P<0.05).在水培条件下,利用转录组学技术分析了拟南芥对FZB42及蔗糖添加的响应,结果表明氨基酸合成,苯丙素生物合成,MAPK信号以及植物-病原菌互作通路的相关基因差异表达.其中,拟南芥地上部苯丙素生物合成通路的差异基因多数上调表达,而地下部则多数下调表达(P<0.05),与RT-qPCR验证结果一致.因此,小分子碳源蔗糖可能通过诱导拟南芥增强地上部的苯丙素合成以响应地下部的FZB42定殖. 2.蔗糖和解淀粉芽孢杆菌的共添加促进掌叶大黄的生长,增强土壤活性和抑制了根际潜在病原菌.通过测定大黄生物量发现,低(0.15‰)和中(1.5‰)浓度蔗糖与解淀粉芽孢杆菌(1.0×105 CFU/mL)的共处理显著促进大黄根的鲜重(P<0.05).利用广泛靶向代谢组学技术,发现低蔗糖与解淀粉芽孢杆菌的共处理可能通过重编程苯丙烷合成通路来显著积累大黄根中的主要活性物质蒽醌类和酚类(P<0.05).尽管高浓度(1 5‰)蔗糖和解淀粉芽孢杆菌的共处理显著增强土壤微生物碳(MBC)的含量,然而低浓度蔗糖和解淀粉芽孢杆菌的共处理则显著增加土壤总钾(TK)的含量(P<0.05),从而调节了土壤中的钾和养分循环的可利用性.此外,大黄根际土壤微生物组测序结果表明,低浓度蔗糖和解淀粉芽孢杆菌的共处理主要降低真菌群落的丰富度而增加其多样性,且能够抑制特定的潜在病原真菌,如镰刀菌属(Fusarium);冗余分析表明鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)的相对丰度与低浓度蔗糖和解淀粉芽孢杆菌的共处理后土壤中的有效钾和总碳呈正相关. 3.比较解淀粉芽孢杆菌菌剂的3种不同施用方式发现,等量菌剂的两种施用方式浸种MZG和撒施M5显著增加马铃薯植株的生物量,且M5诱导马铃薯块茎的光合作用,氨基酸合成,糖代谢在转录水平的全局响应(P<0.05).尽管蔗糖添加剂组MY34马铃薯块茎在转录水平的差异表达较少,但是非靶代谢组结果则表明其与MZG显著积累更多的差异代谢物,分别为甘露二糖和Euchrenoneb6.此外,马铃薯根际土壤微生物组结果表明,3种施用方式均不显著改变细菌和真菌的群落结构,但MY34土壤更易富集特定的微生物,如Arthrobacter属细菌,Plectosphaerella和Mortierella属真菌,这可能是蔗糖添加剂导致的结果. 4.为了获得优质PGPM菌种,以番茄植株和马铃薯块茎为材料,共分离鉴定得到39株菌,选择其中3株PGPM菌株:禾本红酵母(Rhodotorula gramini)J J10.1,绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)T8,耐冷假单胞菌(Pseudomonas psychrotolerans) YY7进行电镜形态观察,全基因组测序及PGP特性鉴定后,与解淀粉芽孢杆菌FZB42一起进行4株复合PGPM菌群的生防评价.菌落互作结果表明该PGPM菌群在两两组合下均互不抑制,且FZB42与YY7的协同产生物被膜的能力显著最强(P<0.05).此外,复合PGPM菌群对拟南芥和番茄的促生能力均显著高于单一菌株,与其产生VOCs对拟南芥的促生能力一致.同时,平板对峙结果表明,除禾本红酵母JJ10.1的拮抗能力较低外,其余3株细菌对2株镰刀菌Fusarium oxysporum和Fusarium chlamydosporum均有较强的抑制作用.尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)在番茄上的回接实验再次证明复合PGPM菌群的强抑菌活性显著优于单一接种(P<0.05). 综上所述,本研究首次表明小分子碳源蔗糖能够通过重编程植物苯丙素合成途径响应解淀粉芽孢杆菌的根际定殖,以此促进植物的生长和抑制潜在病原菌.同时评估了一种新型复合PGPM菌群对植物的促生防病效果,为进一步在可持续农业上开发和应用PGPM复合制剂提供理论依据和应用价值.
