摘要：
番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌Botrytis cinerea引起的一种毁灭性土传病害,对番茄生产造成极大威胁.利用生防菌防治番茄灰霉病被认为是一种有效的绿色防治手段.本研究的目标是分离出一株对番茄灰霉病有良好防治效果的拮抗细菌,通过分析其发酵产物,在番茄根际的定殖及对番茄的促生和抗性诱导进行初步探索,为番茄灰霉病的防治提供理论依据.主要研究结果如下:1,从甘肃省兴隆山原始森林土壤中分离出对番茄灰霉病菌有拮抗作用的细菌XF,抑制率可达66.35%.通过对该菌株的形态学特征观察以及16S rDNA和gyrA序列的分析鉴定,确定菌株XF为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus.2,以灰葡萄孢菌为指示菌,生物量和抑菌率为指标,采用单因素试验和正交优化试验相结合的方法,优化菌株XF的发酵培养基和发酵条件.结果表明:菌株XF发酵最适培养基为:葡萄糖1.00%,蛋白胨1.00%,酵母粉0.50%,NaCl 1.00%,MgSO_4·7H_2O0.10%,色氨酸100 mg/L;最佳发酵条件:初始pH 6.0,温度30℃,发酵周期60 h,摇床转速200 r/min,接种量5%.优化后,将菌株XF的发酵液稀释10倍时,对番茄灰霉病菌的抑制率为98.19%,对番茄离体叶片,盆栽的防效可达66.58%,83.97%.3,菌株XF抗菌物质的分析:首先用平板双扣法和高温灭菌法测得菌株XF的发酵产物中含有抗灰葡萄孢菌的挥发性物质和耐高温性物质;其次用平板验证试验表明,菌株XF的次生代谢物含有蛋白酶,葡聚糖酶,几丁质酶和铁载体;然后采用Salkowski比色法测得菌株XF的发酵液中含有植物生长素(IAA);最后通过对优化前发酵液和优化后发酵液进行LC—MS对比结果分析发现,发酵液中含量增加的物质主要有石竹素,乌索酸,绿原酸,肉桂酸,氯霉素,3,4—二甲氧基苯甲酸以及各种氨基酸等,但具体具有抗性的代谢产物还有待进一步分析.4,菌株XF在番茄根际的定殖:首先对菌株XF进行GFP标记,得到标记菌株XF-pGFP.通过检测生长速率发现,质粒pGFP4412的导入,对菌株XF的正常生命活性影响不大.然后采用喷洒浇灌法将标记菌株XF-pGFP接种在番茄植株根际,通过激光共聚焦显微镜观察发现,其可以定殖在番茄根系,但随着时间的延长,根系观察到的标记菌株XF-pGFP数量逐渐减少.5,通过培养瓶试验和盆栽试验研究了菌株XF对番茄的促生作用和系统抗性的诱导作用.首先通过在MS半固体培养基中加入菌株XF的发酵滤液(V:V=1:100)发现,发酵滤液对番茄种子的萌发有促进作用,且萌发7d内幼苗的芽长,根长,须根数,湿重,干重相比对照组均增加了;其次,通过对番茄幼苗喷洒菌株XF的发酵液试验表明:稀释100倍发酵液对处理20d的番茄植株生物量有明显的促进作用,根活力及叶片中总叶绿素含量,与抗性相关的POD和PAL酶活性均有所提高;最后使用荧光定量法对PR1,PR2,PR8,PAL等PR蛋白基因表达量的分析表明,PR1,PR2,PR8,PAL在番茄植株根,茎,叶部位的相对表达倍数均增加.
