摘要：
荔枝(Litchi chinensis Sonn.)是中国岭南名果,因味美、外形可爱而深受人们的喜爱。由荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii Chen ex Ko et al.)侵染引起的荔枝霜疫病是荔枝上重要的采前采后病害,可导致果实大量腐烂。目前主要是采用化学药剂来防治该病,但化学防治导致农药残留、污染环境等问题会给荔枝出口及产业的可持续健康发展蒙上阴影,因此,生物防治成为该病防治研究的热点。链霉菌是重要的农业微生物资源,其代谢产生的抗生素及其它生物活性物质已用来防治多种植物病害。本研究从海南省昌江县霸王岭野生荔枝树下的土壤中分离筛选到两株对荔枝霜疫霉具有很强抑菌活性的链霉菌菌株TJGA-19、BWL-H1,在此基础上,对它们的分类地位、发酵优化、抑菌活性、防病潜力以及抑菌机理等方面进行了系统的研究,主要研究结果如下:1.采用平板稀释法对28份土壤样品进行分离纯化后获得476株放线菌,去重后剩下163株。综合菌体和发酵滤液的抑菌活性测定,从163株放线菌中筛选出1株对荔枝霜疫霉具有强烈拮抗作用的菌株TJGA-19,该菌株抑菌谱很广,其菌体及发酵液对多种植物病原菌物均表现出明显的抑菌活性;通过双皿对扣测定方法,筛选到2株挥发性物质可显著地抑制荔枝霜疫霉生长的放线菌,菌株BWL-H1的抑菌率达94.6%,菌株TJGA-19的抑菌率为86.3%。2.采用传统分类鉴定方法和16S rDNA序列分析,将菌株TJGA-19和BWL-H1分别鉴定为链霉菌属阿孙链霉菌霸王岭变种(Streptomyces abikoensis var.bawanling-ensis TJGA-19)和粪生链霉菌(S.fimicarius BWL-H1)。3.对菌株TJGA-19的发酵条件进行优化,结果表明:黄豆粉对抑菌活性物质的产量影响最大,其次为可溶性淀粉,(NH_4)_2SO_4、NaCl和酵母粉对菌株TJGA-19抑菌活性物质的合成也有一定的促进作用。最佳发酵培养液配方为:可溶性淀粉2.5%,黄豆粉5.5%,(NH_4)_2SO_4 0.2%,NaCl 0.2%,酵母粉0.1%;最佳发酵条件为摇床转速180 rpm、温度为28℃、pH 7.0、发酵时间为7 d、装液量为250 mL三角瓶装液60 mL。4.研究了菌株TJGA-19产生的抑菌活性物质的稳定性,结果表明:TJGA-19产生的抑菌活性物质在可见光、紫外光、高温、pH7~12中性及碱性环境和蛋白酶K处理中均表现出很强的稳定性。但在pH≤6的酸性环境中,抑菌活性显著下降。5.研究了菌株TJGA-19发酵滤液对荔枝霜疫霉的抑制作用及防治效果。结果表明,TJGA-19发酵滤液对荔枝霜疫霉菌丝生长、孢子囊产量、孢子囊萌发和卵孢子形成具有很强的抑制作用。光学显微镜及扫描电镜观察到2%发酵滤液处理的菌丝体严重畸形、过度分枝、生长缓慢、原生质外渗,菌丝体凹陷。荧光染色实验观察到5%、10%的发酵滤液处理的菌丝体绿色荧光信号强烈,此结果表明了抑菌活性物质破坏了菌丝体细胞膜的透性。对荔枝霜疫病的防治效果研究显示,发酵滤液对荔枝霜疫病有很好的防效,10%发酵滤液喷雾接种叶片的发病率为24.1%、病斑直径为2.6 mm,显著低于对照的发病率97.3%和病斑直径18.3mm。6.研究了菌株TJGA-19产生的挥发性物质对荔枝霜疫霉的抑菌机理及防病效果。结果表明:TJGA-19产生的挥发性物质对荔枝霜疫霉菌丝生长、孢子囊和卵孢子的形成具有强烈的抑制作用,挥发性物质的浓度越大,抑制作用越强;可有效控制荔枝霜疫病的发生,但对荔枝霜疫霉孢子囊萌发没有抑制作用。扫描电镜观察到,挥发性气体薰蒸的荔枝霜疫霉菌丝体塌陷、干瘪,孢子囊细胞壁粗糙、下陷,透射电镜观察到菌丝细胞中细胞器消解、空泡化。32 g/L的TJGA-19小麦粒培养物对离体叶片荔枝霜疫病有很好的防效。经GC-MS分析,从TJGA-19产生的挥发性物质中鉴定出22种化合物。这些化合物多属于烯类、醇类、酯类、烷烃等,其中含量最大的是2-Methylisoborneol。7.研究了菌株BWL-H1产生的挥发性物质对荔枝霜疫霉的抑菌机理及防病效果。结果表明:BWL-H1产生的挥发性物质的抑菌谱很广,能够抑制15种植物病原菌的生长,其中对荔枝霜疫霉、群结腐霉(Pythium myriotylum)、链格孢属(Alternaria alternata)、香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musarum)、水稻稻瘟病菌(Pyricularia grisea)抑制作用最强,抑制率达100%。挥发性物质能够抑制荔枝霜疫霉菌丝生长、孢子囊和卵孢子的形成及芽管穿透玻璃纸的能力,可有效控制荔枝霜疫病的发生。电镜观察结果表明:荔枝霜疫霉经挥发性气体薰蒸可导致菌丝体塌陷干瘪、孢子囊细胞壁粗糙且下陷、菌丝细胞中细胞器消解、菌丝细胞空泡化、菌丝细胞的细胞膜内陷而产生质壁分离;在荔枝霜疫霉侵染离体叶片的实验中观察到荔枝霜疫霉的侵入与扩展均受到强烈抑制。经GC-MS分析,培养14 d和21d的BWL-H1分别产生12和21种挥发性物质,多属于烯类、醇类、酯类、酮类和烷烃。从这些化合物中选取8种化合物对荔枝霜疫霉菌丝生长、孢子囊产量、孢子囊萌发和芽管生长的影响进行测定,结果表明,除了Humulene外,其它7种化合物均具有很强的抑制作用,其中4-ethyl-Phenol的抑菌活性最强。
